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肝脏去唾液酸糖蛋白受体的发现及其临床应用研究

  肝脏去唾液酸糖蛋白受体靶向基因药物对肝脏疾病的治疗研究取得了突破性进展,下面是小编搜集整理的一篇探究肝脏去唾液酸糖蛋白受体应用的论文范文,欢迎阅读参考。

  肝脏去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteinreceptor,ASGPR),最初由Ashwell及其同伴发现,由于它能迅速清除血循环中末端为β-1,4链半乳糖的寡糖糖蛋白,因此而被识别和定义[1]。ASGPR主要生理功能是介导血液中去唾液酸糖蛋白、脂蛋白等物质的清除,且与病毒性肝炎、肝硬化、肝癌等肝脏疾病的发生发展有着密切联系。ASGPR的发现并将之用于临床,对肝脏疾病的诊断及治疗起着重要作用[2]:(1)将生物活性分子连接到半乳糖末端,使之高效到达目标组织,进行诊断和治疗;(2)运用细胞表面特定受体促进对受损细胞的修复;(3)监测血清中的去唾液酸糖蛋白,用以评估肝硬化、肝炎、原发性肝癌患者的肝细胞损伤程度等。

  为了提高ASGPR在临床上的应用价值,近来各国学者对ASGPR的研究也有了更为深刻的突破。

  一、SGPR的结构、基因与生理功能

  1.结构:ASGPR,也称肝凝集素,是一种异源低聚物内吞受体,数量丰富,主要位于窦状隙一侧的肝细胞膜表面。ASGPR属于质膜上的Ⅱ型跨膜受体,分为四个功能区:胞质区、垮膜区、蒂区和糖识别域(carbohydraterecognitiondomain,CRD);CRD属于C型(钙依赖)凝集素的超家族,它能结合去唾液酸的非还原半乳糖残基和N-乙酰半乳糖胺,增加受体配体的亲和性,被认为是ASGPR最重要的部分[3]。

  2.基因:ASGPR能被传统的亲和层析法纯化。从兔肝分离出大小分别为40kDa和48kDa的蛋白质(比例2∶1),而大鼠肝脏则分别为42kDa,49kDa和54kDa(比例8∶l∶1),仅人肝细胞和肝癌细胞中的受体分离纯化出单一蛋白,大小为46kDa。人HepG2细胞中有两种ASGPR蛋白(H1和H2),它们的mRNA近似等量,并以(2~5)∶l的比例被翻译为主要和次要形式。氨基酸序列暗示H1亚基包含一段约40个氨基酸的N端胞质区,约20个氨基酸的跨膜区,约80个氨基酸的胞外茎区以及一段约140个氨基酸的CRD[4-5]。

  3.生理功能:ASGPR大量存在于肝细胞的质膜上,并且能被快速内化,这种特性赋予它清除血循环糖蛋白的巨大潜能,由此管理去唾液酸血清类黏蛋白(ASOR)的内稳态。ASGPR的天然配体由多种半乳糖或半乳糖胺组成,包括脱唾液酸血清类黏蛋白、去唾液酸铜蓝蛋白、去唾液酸运铁蛋白[5],ASGPR通过识别半乳糖残基或N-乙酰半乳糖胺而介导ASOR的清除,这一过程具有高度特异性。

  ASGPR的所有亚基都参与了结合配体的功能:在H2缺乏的条件下,H1能被正常运送至细胞表面但却不能结合ASOR,相反,仅有H2表达的ASGPR会被迅速分解,不会到达质膜;而H1亚基的表达是H2亚基有效转运至细胞表面的前提[4]。

  二、ASGPR参与相关肝脏疾病的发生发展

  ASGPR可在一定程度上反映有效肝细胞功能,在肝炎、酒精性肝病或肝癌等肝脏疾病发生时,其数量和活性均受到损害。受体介导的内吞作用可能是毒性诱导肝损伤的一种新型机制,适当的ASGPR功能和数量能针对各种毒性介导的肝损伤提供;6]。根据ASGPR数量及活性的改变,还可预测术后肝功能代偿情况的准确率,李勤涛等[7]就应用ASGPR及临床指标建立了肝储备功能定量评估系统,对ASGPR进行了进一步探索。

  1.乙型病毒性肝炎:纯化HBV粒子能与HepG2细胞结合,通过阻断ASGPR的功能显着抑制两者结合。乙型肝炎病毒(HBV)preS1相关的病毒性膜结合位点附着于ASGPR,HBV由此通过ASGPR分子进入到人体的肝细胞中。胞膜上的preS1和ASGPR具有共同表达区域,它们的表达呈显着的相关性(Pearsoncorrlection相关系数为0.776,P<0.0001)。这表明ASGPR可能是介导病毒进入宿主细胞的一个HBV结合伴侣[8]。Diao等发现ASGPR不仅能与HBV感染肝细胞,还能与其抗体在动物体内形成的复合物,诱发宿主体内的自身免疫反应,使急性乙型肝炎向慢性转化,加重组织学损伤[9]。外ASGPRH1亚基的CRD也是甲型肝炎病毒和马尔堡病毒的入侵位点[10]。

  2.慢性酒精性肝。壕凭喙氐母卧嗨鹕私逃刖凭盏嫉腁SGPR含量降低之间存在着密切关联。在先前的研究中对离体肝细胞进行酒精干预,大量ASGPR位点的内吞过程受到损害,从配体的结合、内化到分解,乃至受体的再循环能力都大大降低。在乙醇饲养的野生型大鼠肝细胞中,ASGPR的配体结合、内吞和降解作用减少了45%~50%。慢性酒精干预减少了ASGPR特定的mRNA,使得ASGPR在数量上也大大降低。酒精饲养大鼠的肝细胞还增加了细胞凋亡的敏感性而促使细胞凋亡,最终发展成为脂肪肝[11-13。

  3.原发性肝癌:有学者利用组织微阵列技术探查了一个相对较大的样本含量,以检测ASGPR在正常肝脏和不同等级肝细胞癌中的表达模式和表达量。肿瘤样本中的总体表达模式比起毗邻的正常组织来说具有显着不规则性。ASGPR表达水平的免疫组化评分(H-score)显示,高分化肝细胞肝癌(HCC)的ASGPR表达水平与毗邻正常肝组织相似,而中等分化与低分化HCC的ASGPR表达水平会降低,与毗邻的正常肝组织相比,差异具有显着性统计学意义[5]。有学者[14]认为ASGPR可能在淋巴细胞的生理调节中具有重要作用:T细胞介导的肝脏损伤敏感性在ASGPR缺乏大鼠体内有所增强,适当的ASGPR功能对T细胞介导的肝炎具有;ぷ饔;Grewal等报道,ASGPR在血管性血友病的体内平衡因素中占有一角,还能促进链球菌肺炎败血症的血小板减少症的发生[15]。

  三、ASGPR显像剂的研究进展

  ASGPR的数量和活性与肝实质细胞的功能直接相关,因此,对ASGPR进行定量分析可以对肝脏功能进行评估,ASGPR显像剂实现了这一构想。

  1.99mTc标记的显像剂:Chang等[16]用高放射化学纯度合成和标记99mTc-MAMA-MGa(lMonovalentgalactoside,单价半乳糖苷)和99mTc-MAMA-DGal(Divalentgalactoside,双价半乳糖苷),并对正常和肝纤维化大鼠的两条路径进行动态microSPECT显像和生物分布研究,显示99mTc-MAMA-DGal对肝脏ASGPR具有更高的结合特异性,而且能迅速通过肝胆系统和肾脏清除系统排泄出体外,说明99mTc-MAMA-DGal也能被用作非侵入性评价ASGPR相关肝脏功能障碍的单光子发射计算机断层成像术(single-photonemissioncomputedtomography,SPECT)探针。另外Sugahara等[17]首次针对急性肝炎(acutehepatitis,AH)和爆发性肝功能衰竭(fulminanthepaticfailure,FHF)的区域ASGPR表达进行99mTc-半乳糖化人血白蛋白(galactosyl-humanerumalbumin,GSA)SPECT分析,这对检测区域肝损害的严重性和评价区域肝再生具有临床意义。全肝对99mTc-GSA的肝脏摄取率(liveruptakeratio,LUR)及肝吸收密度(liveruptakedensity,LUD)与肝储备功能和总胆红素水平具有良好相关性,且右叶的LUR、LUD水平与这些参数的相关性更为显着。全肝和肝左右叶的LUR及LUD的降低程度与急性肝损伤的严重性是一致的,而在FHF中,右叶LUR和LUD的减少比左叶更为显着。无论是AH还是FHF,ASGPR在右叶中的表达比左叶更为迅速。龙彦军等[18]制备出99mTc标记的壳聚糖-乳糖酸复合物(99mTc-LA-CS),并观察了99mTc-LA-CS在正常裸鼠体内的生物分布情况及去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)介导的肝细胞靶向作用,结果发现放射性核素99mTc标记的LA-CS在肝细胞中具有特异性摄取,提示99mTc-LA-CS可以作为ASGP-R介导的肝脏显像剂用于肝细胞成像。Ohno等[19]还引入独特的参数在99mTc-GSA闪烁法中,即平均传输时间(meantransittime,MTT)和功能显像,能使我们定量和可视化地阐明肝细胞的区域动态功能。

  2.18F标记的显像剂:Kao等[20]对18F-FBHGal进行了研究。它是一种新型的18F标记的单价半乳糖衍生物,是正常以及肝纤维化大鼠模型的ASGPR特异性PET探针。研究显示纤维化肝脏中的18F-FBHGal积累比正常肝脏有着显着性的降低,因此能对ASGPR相关的肝脏功能紊乱提供新的见解。

  3.188Re标记的显像剂:Cheng等[21]研制并标记了一种新型的糖肽衍生物188Re-OCTAM。他利用血吸虫感染大鼠实验来评价OCTAM评估残余肝功能的潜力,并对不同感染水平的大鼠进行肝功能评分。病理和生化分析证实感染引发的渐进性积累肝损伤能影响肝脏对188Re-OCTAM的摄取,这说明同位素标记的OCTAM可能具备评估血吸虫肝功能的显像剂的潜力。

  4.MRI造影剂半乳糖化锰铁氧体纳米粒子(G-MFNP):锰铁氧体纳米粒子(manganeseferritenanoparticles,MFNP)能被作为诊断癌症的超敏感的MRI造影剂,它具有强烈的MR对比效应,比氧化铁纳米颗粒增加了160%。Yang等[22]制备出ASGPR靶向性显影剂G-MFNP,它能特异性靶向结合表达ASGPR的HepG2细胞。

  5.超声造影剂:Kaneko等[23]发现ASGPR靶向超声造影剂中的微泡在高机械指数的作用下可破裂并产生信号强度,此信号强度可以反映肝纤维化的严重程度。余进洪等[24]制备出ASGPR液态氟碳靶向纳米脂质造影剂,通过超声造影检查能在体无创地评价ASGPR表达量的变化,有利于评估肝脏功能。

  近来,带有半乳糖基的超支化聚酰胺纳米粒子、白蛋白纳米粒子、量子点、氧化铁颗粒也在肝脏靶向显影中得到研究。Abe等[25]也制备出带有不同稳定性和清除率的新型构造,包括125I、99mTc、153Gd和111In标记的去唾液酸糖蛋白,它们不同的摄取率和清除率能用来确定肝脏和移植肝细胞的功能活动性。

  四、ASGPR的基因及药物靶向性研究

  ASGPR跨膜引入大分子的能力使之成为一个靶向药物至肝细胞或肝癌细胞的首选目标[26]。Rozema等证实了乙酰半乳糖胺共轭的siRNA分子仅仅聚集在肝细胞中,使得ASGPR靶向的概念也有据可循[5]。靶向性治疗策略要求抗体-药剂的结合物针对性的输送至肿瘤细胞。Coulstock等[27]将IFN-α融合至ASGPR特异性抗体上,合成的融合蛋白(mIFNα2-ASGPRdAb)对肝脏具有更加显着的靶向功能。这样对肝脏特定区域进行药物治疗便能减少血液和周边组织对干扰素的暴露,以此增加干扰素治疗的安全性和耐受性;Zhao等[26]将蜂毒素转染至一个抗ASGPR的单链可变片段抗体,构建成一个重组的免疫毒素,对肝肿瘤细胞进行靶向溶解。

  目前报道的最有效的一种阳离子脂质体基因递送系统是脂质鱼精蛋白DNA(LPDs),它具有比传统脂质体更优越的基因传送能力,Lu等[28]据此制备出新型胆固醇衍生物组成的LPDs,进行肝细胞靶向基因送达;Díez等[29]研发了一种新型的靶向性阳离子纳米粒子系统,由PLGA[poly(D,L-lactic-co-glycolicacid)]、DOTAP[1,2-dioleoyl-3-(trimethylammonium)propane]和去唾液酸糖蛋白(asialofetuin,AF)组成,是一种靶向基因至肝肿瘤细胞的高效配方,载有治疗基因IL-12的纳米粒子具有很高的血清浓度,这可能会成为体内应用的潜在系统;Valenttijn等[30]也通过一种固相合成手段合成了一系列群集半乳糖苷YEE(ah-GalNAc)3类似物,即YEEE(a-ah-GalNAc)3,它允许装载治疗性化合物、荧光物质,并能对肝脏进行选择性递送,可作为一个有效的载药或载基因配体。

  Guhagarkar等[31]探讨了采用聚葵二酸酯阿霉素纳米粒子(PES-DOXNP)作为ASGPR配体进行肝靶向的研究。它们采用纳米沉淀技术获得具有高截留效率和高药物加载的纳米粒子,赋予它长时间循环特性和增强的靶向能力,以此提高肝癌的治疗效果。Ma[32]研制了一种shRNA(pGenesil-siHBV4),能够有效抑制人肝癌细胞HepG2.2.15中的HBV复制,减少HBV的mRNA水平,HBsAg和HBeAg的蛋白水平以及分泌型HBVDNA;这种新型shRNAs的肝ASGPR靶向策略是一种能够高度特异性抑制HBV复制和消除肝癌细胞的方法。

  Peng等[33]报道了一种将凋亡蛋白基因连接在ASOR上的系统性运载工具,它能靶向肝细胞表面的ASGPR。对带有原位肝癌的大鼠进行尾静脉注射ASOR-凋亡蛋白,肝癌细胞和正常肝细胞均可发现凋亡蛋白的分布,注射5d过后,原位肝癌显示了明显的衰退信号,而周围正常肝细胞却没有。ASOR-凋亡蛋白全身给药能特异性诱导恶性肝细胞的凋亡,因此构成了一种针对肝细胞癌的强力且安全的疗法。

  五、ASGPR应用的前景及展望

  ASGPR为肝脏定向转移的最佳受体,为肝脏疾病的治疗、肝功能的检测和肝脏基因的定向表达提供了良好的途径。ASGPR显影能对肝功能进行正确评估,帮助预测手术风险、制定合适的治疗方案、降低肝脏手术的围手术期死亡率,但在显影剂的制备上还存在稳定性、组织通透性等缺陷。

  ASGPR靶向基因药物对肝脏疾病的治疗研究也取得了突破性进展,但对于复合物的制备也有很大的不足,比如大小和浓度的缺陷都会限制其应用。相信随着生物技术的发展,这些问题都能逐个解决,ASGPR显像剂及ASGPR介导的基因和药物转移技术拥有着广阔的应用前景。

  参考文献

  [1]SteirerLM,ParkEI,TownsendRR,etal.TheAsialoglycoproteinReceptorRegulatesLevelsofPlasmaGlycoproteinsTerminatingwithSialicAcid_2,6-Galactose[J].JBiolChem,2009,284(6):3777-3783.

  [2]AshwellG,HarfordJ.Carbohydrate-specificReceptorsoftheLiver[J].AnnRevBiochem,1982,51:531-554.

  [3]MeierM,Bider,MalashkevichVN,etal.CrystalStructureoftheCarbohydrateRecognitionDomainoftheH1SubunitoftheAsialoglycoproteinReceptor[J].JMolBiol,2000,300(4):857-865.

  [4]SpiessM.TheAsialoglycoproteinReceptor:AModelforEndocyticTransportReceptors[J].BiochemistryVof,1990,29(43):10009-10018.

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