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探讨RhD阳性血影细胞的制备及应用

时间:2018-01-20 药学毕业论文 我要投稿
摘要:目的: 探讨用不同渗透浓度磷酸盐液(PB)制备的RhD阳性血影细胞的抗原性及其在抗-D 抗体分离中的作用。方法: 用不同渗透浓度PB作为裂解液,将遗传表现型为CCDee的RhD阳性O型红细胞制备成血影细胞,观察其抗原性;以血影细胞为固相抗原,用亲和层析法从抗D含量为0.814 mg/L的健康人血浆中分离抗-D抗体,检测相关指标。结果: pH7.4、30 mmol/L PB制备的血影细胞形态完整,保持较强的抗原性;成功获得抗-D抗体,回收率达到84.65 %,IgG单体加二聚体含量为99.3 %,不含抗A、抗B血型抗体以及IgA、IgM和血红蛋白。结论: 用pH7.4、30 mmol/L PB制备的血影细胞可作为固相抗原,并能从低效价血浆中分离纯化抗-D抗体。

关键词: RhD抗原 抗-D抗体 血影细胞 血浆

   抗-D抗体被广泛用于防止RhD同种免疫[1,2],同时也用于治疗特发性血小板减少性紫癜[3,4]。目前临床使用的抗-D抗体均为人为免疫而得的血源制剂[5],而因妊娠等自然免疫而产生的获得性抗D抗体,由于其血液中含量少,没有受到重视而得到利用。2006年用不同渗透浓度的磷酸盐液(PB)制备RhD阳性血影细胞,并探讨其对血影细胞抗原性的影响,探索用血影细胞从含低效价抗-D抗体的血浆中分离纯化抗体的方法及其可用性。
  1 材料和方法
  1.1 材料
  健康人血浆(抗D为0.814 mg/L,IgG含量9.63 g/L,贵州省血液中心),Rh表型CCDee的O型红细胞(贵州省血液中心),效价为1∶256的抗D(IgG)血型抗体标准品(上海市血液中心),溶血素(中国生物制品质量检测所),FITC-兔抗人免疫球蛋白(晶美公司),MININEPHTMIgG抗血清(英国The Binding site公司),99/728抗-D抗体标准品(英国The National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC),免疫单扩散板(上海捷门生物技术合作公司)。8200型超滤器、截留分子量30 kD的超滤膜(美国Millipore公司),3K30型低温高速离心机(德国Sigma公司),FACSCabiber式细胞仪(美国Becton Dickinson公司),高效液相色谱仪(美国Waters公司),MININEPSAN散射比浊仪(英国The Bingding Site 公司)。
  1.2 血影细胞的制备
  O型Rh表型CCDee的红细胞,等体积生理盐水洗涤3次(1 000 r/min×5 min,4 ℃),pH7.4,渗透浓度分别为40、30 和20 mmol/L的PB多次洗涤离心(20 000 r/min×15 min,4 ℃)至上清液无色,沉淀即为含D抗原的血影细胞。
  1.3 血影细胞形态和抗原性检测
  在光镜下观察血影细胞的形态。将血影细胞与标准抗-D抗体37 ℃孵育30 min,离心取上清液,用RhD筛选细胞测定其抗体效价,标准抗-D抗体效价减去上清液效价反映血影细胞的抗原性,相同条件重复5次。
  1.4 血浆抗D-抗体的分离纯化
  血影细胞用2%戊二醛2∶1的体积比固定30 min后与血浆按1∶2的体积比例混合,37 ℃轻柔搅拌2 h,离心(1 000 r/min×5 min,4 ℃)弃上清,沉淀的细胞用10倍体积的pH2.8,0.2 mol/L的甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱,离心( 1 000 r/min×3 min),洗脱液用0.05 mol/L NaOH调pH至6.0~6.5,重复两次,合并洗脱液,超滤浓缩至原血浆体积的1/5,过滤除菌,冷冻干燥,4 ℃保存。相同条件重复7次。
  1.5 抗体测定
  终点散射比浊法测定IgG含量,免疫单扩散法检测IgA和IgM含量,高效液相色谱法测定IgG单体加二聚体含量,流式细胞术测定抗-D抗体含量,邻甲联苯胺法行血红蛋白定性测定,试管法测定抗A、抗B血型抗体。
 2 结果
  2.1 血影细胞的形态
  用渗透浓度为20 mmol/L的PB制备的血影细胞形态不规则,混有较多细胞碎片;用30和40 mmol/L的PB制备的血影细胞呈透明圆形,未见明显细胞碎片,但40 mmol/L的PB制备的血影细胞内含有少量血红蛋白,细胞中心可见红色。
  2.2 血影细胞的抗原性
  抗-D标准品效价为1∶256,表1显示血影细胞与抗-D抗体标准品孵育后,重复 5次的结果。用20 mmol/L的PB制备的血影细胞与抗-D抗体标准品孵育后,四次上清液中的抗体效价为1∶128;而用30和40 mmol/L的PB制备的血影细胞与抗-D抗体标准品孵育后,上清液中的抗体效价在1∶16与1∶32之间。表1 标准抗体与血影细胞孵育后上清液的抗体效价(略)
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