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柳茶多糖的分离纯化及气相色谱-质谱分析

时间:2018-04-04 药学毕业论文 我要投稿

  目的探索川麦冬须根普通粉和超细微粉间表面特性和溶出性的差异,以便更好地利用川麦冬须根资源。方法通过普通光学显微镜、电子显微镜对普通粉和超细微粉的形态学观察,通过对粒径、分布宽度、比表面积、松密度、压缩度及其浸出物测定等方法对其普通粉和超细微粉进行比较分析。下面是小编搜集整理的相关内容的论文,欢迎大家阅读参考。

  【摘要】 目的首次提取柳茶中的水溶性粗多糖并进行分离、纯化及组成分析。方法柳茶经热水提取、乙醇沉淀、Sevag法去蛋白、H2O2脱色,逆向流水透析得多糖精制品。将精多糖衍生化后运用气相色谱-质谱法对其化学成分进行分析。结果确定了柳茶中水溶性多糖分别由核糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,其中以核糖、葡糖糖、半乳糖为主。结论该方法简便、灵敏,可以准确测定出柳茶多糖中所含有的各种单糖。

  【关键词】 柳茶多糖; 纯化; 气相色谱-质谱; 单糖

  柳茶为藏族民间常用药,以蔷薇科(Rosaceae)鲜卑花属(Sibiraea)植物窄叶鲜卑花Sibiraea angustata (Rehd.) Hand-Mazz. 和鲜卑花Sibiraea laecigata (L) Maxim.的枝叶及果序(带果实的果枝)入药,主要用于消食导滞、疏散风热;据藏药文献记载,柳茶主治热病和疫病[1]。现藏族民间常作茶饮,治疗食后腹胀等诸多原因引起的消化不良,每每见效。柳茶中除含有挥发油、微量元素外,通过实验发现还含有丰富的多糖。多糖作为提高机体免疫功能的保健品已被许多人接受,但许多多糖产品仅仅停留在保健品阶段,未能开发成药物,主要原因是多糖的分离纯化困难,技术不过关。因此本文旨在对柳茶多糖的提取、纯化、组分分析进行研究并对其营养保健功能进行探讨,以期为柳茶的开发及其综合利用提供参考。

  一、仪器与材料

  1.1 仪器 UV-2450紫外分光光度计(日本岛津) ; NE2155电子天平(德国赛多利斯仪器公司);Agilent 5793I-6890气相色谱-质谱联用仪(GC-MS);SE-54弹性石英毛细管柱(50 m×0.25 mm id×0.50 μm);高纯氦(纯度≥99.999%);旋转蒸发仪(上海青浦泸西仪器厂)。

  1.2 材料 鲜卑花属植物叶采自甘肃省甘南藏族自治州合作市郊,海拔3 200 m以上。经兰州大学药学院生药学研究所杨永建教授鉴定其为蔷薇科(Rosaceae)鲜卑花属(Sibiraea)植物窄叶鲜卑花Sibiraea angustata (Rehd.) Hand-Mazz. 和鲜卑花Sibiraea laecigata (L) Maxim.的叶。

  单糖标准品葡糖糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖标准品 (Fluka公司),盐酸羟胺、吡啶、三氟乙酸、乙酸酐、氯仿以及其他试剂等均为国产分析纯,蒸馏水为实验室自制。

  二、方法

  2.1 多糖的提取与纯化

  2.1.1 粗多糖的提取取一定量的柳茶依次用石油醚、乙醚除去脂溶性杂质。加10倍量的水90~100℃提取3次,3 h/次,合并水提液,过滤。70℃水浴减压浓缩至适量,加入5倍量95 %的乙醇纯析,静置过夜,离心过滤,置真空冷冻干燥得柳茶多糖粗品。

  2.1.2 粗多糖纯化[2]将多糖粗品溶于蒸馏水,去不溶物,按Sevag法(氯仿∶正丁醇=4∶1)脱蛋白,重复10次以上,然后移至透析袋中用去离子水逆流透析24 h,直至紫外光谱分析检测无蛋白吸收。以氨水调节pH为8,滴加H2O2,50℃保温脱色2 h,减压浓缩,加入5倍量的无水乙醇,静置过夜,离心收集沉淀,将沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚漂洗2次,冷冻干燥得去蛋白多糖纯品。

  2.1.3 紫外光谱分析 取柳茶多糖适量,加水溶解,配制成浓度为1.0 g/L的多糖水溶液,采用紫外可见分光光度法190~700 nm范围内扫描。光谱显示柳茶多糖具有多糖特征性的紫外吸收图谱仅在200 nm处有一锐细吸收峰,大于250 nm无明显的紫外吸收,是平坦的背景。结果表明,提取纯化的多糖中不含有核酸、蛋白质以及其他杂质成分。

  2.2 柳茶多糖的气相色谱质谱测定

  2.2.1 供试品溶液(糖腈乙酰酯衍生物)的制备称取20 mg柳茶纯化多糖样品溶于2 ml 2 mo1/L的TFA中,封管,于100℃水解6 h,减压除尽TFA。在水解产物中加入20 mg盐酸羟胺和1 ml吡啶,封管于90℃反应30 min。冷至室温,再加入1 ml乙酸酐,封管于90℃反应30 min,冷却后转出上层清液,减压浓缩至干。滴入0.5 ml氯仿溶解后进行气相色谱——质谱分析。

  2.2.2 对照品溶液的制备精密称取单糖标准品葡糖糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖对照品20 mg,采用上述方法制备乙;苌,氯仿溶解后进行气相色谱—质谱分析。

  2.3 GC-MS分析条件

  2.3.1 色谱条件SE-54毛细管柱,气化室温度270℃,柱前压17.8 kPa,分流比30∶1,采用恒流模式载气He流量1.2 ml/min,进样量1 μl,程序升温:起始温度100℃保持6 min,以20℃/ min 升至220℃保持14 min,以5℃/ min 升至290℃。

  2.3.2 质谱条件电子轰击源(EI),电子能量70 eV ;离子源温度:230℃;四极杆温度:150℃;传输杆温度:280℃;扫描范围:14~400 amu。

  三、结果

  3.1 单糖标准品和柳茶多糖的GC—MS分析

  3.1.1 混合单糖标准品乙;苌锏淖芾胱恿魍技1。根据单糖标准品的乙;苌锏腉C-MS的总离子流图,确定7种混合单糖标准品的GC一MS总离子流图的出峰顺序为果糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。

  3.1.2 柳茶多糖的乙;苌锏淖芾胱恿魍技2。根据柳茶多糖的总离子流图,通过各峰的保留时间和标准质谱尼斯特谱库(NIST)对照分析可以确定其含有核糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,出峰时间及其组成含量见表1。

  四、 讨论

  分析多糖中单糖组成,首要的工作就是将多糖样品进行彻底的水解。因为如果水解效果不理想,多糖很难完全水解为单糖或者仅仅有很少部分水解,导致样品水解衍生化产物在气相色谱分析中峰值很小,从而影响多糖中含量较少的单糖测定。通过对影响水解效果的各种因素的综合考察分析,得出对于柳茶多糖的水解应采用2 ml 2mo1/L的TFA水解6 h较为合适。在此水解条件下,可以使多糖较为完全地水解。而硫酸也可用于多糖的水解,但实验时采用低浓度的硫酸水解时效果不理想,高浓度的硫酸则易造成多糖的碳化。且由于硫酸沸点比较高,水解后残留的酸不容易挥发除去,必须用碳酸钡中和处理,容易造成样品组分的损失。

  柳茶多糖中的单糖含量

  柳茶多糖在空气中提取或干燥时颜色会加深,可用过氧化氢或活性炭脱色,活性炭在脱色时使用量大,样品损失较多,故采用H2O2脱色。在用过氧化氢脱色处理后,一定要透析至无过氧化氢检出,H2O2检出用高锰酸钾法。此外,在醇洗及醚洗、抽滤时用薄膜盖住样品,可减少空气接触,防止颜色加深。在脱色时50℃保温脱色2 h,时间短色素太多影响检测结果,时间长也没有更好的脱色效果。

  柳茶中除含有挥发油、微量元素、三萜类化合物等多种化学成分外,课题组发现其所含多糖也是其主要活性成分之一;多糖作为药物应用是在20世纪40年代,自20世纪60年代以来,人们陆续发现多糖具有更多的生物活性。不仅具有免疫调节功能,还可以抗感染、降血糖和抗肿瘤等,随着多糖类化合物研究的深入,其在抗肿瘤和病毒的临床治疗方面显示了广阔的应用前景。本文首次对柳茶多糖的化学组成进行研究,对开发利用本地资源有一定的意义。对其化学结构的进一步研究,将有利于阐明其活性与成分的关系。

  【参考文献

  [1] 甘肃省卫生局.甘肃中草药手册,第3册[M].兰州:甘肃人民出版社,1973:1554.

  [2] 方积年,丁 侃.天然药物-多糖的主要生物活性及分离纯化方法[J].中国天然药物,2007,95(5):338.

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